Cuantificación de ARN y ADN en organismos planctónicos marinos mediante SYBR Green II y nucleases. Parte B. Cuantificación en muestras naturales

Resumen

En este trabajo se han desarrollado los protocolos de extracción de ARN y ADN en extractos no purificados de muestras naturales de microplancton. La metodología es compatible con el ensayo fluorimétrico para ARN y ADN desarrollado por Berdalet et al. (2005). La extracción de los ácidos nucleicos se realiza combinando una rotura celular mecánica (mediante un homogeneizador manual de tejidos) con una extracción química (con 0.5% de sarcosina y 0.5 mM EDTA en tampón Tris 5 mM a pH 8). Este nuevo procedimiento de extracción y ensayo se usó para estimar los cocientes ARN/ADN en larvas de peces y comunidades naturales de microplancton mantenidos en el laboratorio bajo diferentes condiciones nutricionales. En los dos experimentos los cocientes ARN/ADN estuvieron relacionados con los nutrientes disponibles para los organismos. El nivel de sensibilidad del método fue establecido experimentalmente a aproximadamente 40 ng de ARN y 10 ng de DNA en ensayos de 1 ml, lo que corresponde a un requerimiento mínimo de biomasa de aproximadamente 400 ng ml^-1 de proteína o 3 ?g ml^-1 de peso seco. La precisión, estimada en distintos pasos del método, tuvo un coeficiente de variación global del 10%. Esta nueva aproximación proporciona cocientes ARN/ADN comparables a las obtenidas con bromuro de etidio.