Cuantificación de ARN y ADN en organismos planctónicos marinos mediante SYBR Green II y nucleases. Parte A. Optimización del ensayo

Resumen

En este trabajo se desarrollan los protocolos para la cuantificación de ARN y ADN en extractos no purificados de plancton utilizando SYBR Green II. El método se basa en la fluorescencia de 3 alícuotas: la primera mide el ARN tras la digestión del ADN; la segunda mide el ADN tras la digestión del ARN y la tercera mide la fluorescencia residual tras la digestión tanto del ARN como del ADN. La medida de esta fluorescencia residual es crítica para obtener una buena estimación de los ácidos nucleicos. Se describen las condiciones de optimización del ensayo: concentración de fluorocromo, composición del tampón, estabilidad de la fluorescencia, temperatura y duración de la incubación con nucleasas. En el procedimiento optimizado los ensayos se realizan en tampón Tris 5 mM (0.9 mM CaCl₂·2H₂O y 0.9 mM MgCl₂·6H₂O); las incubaciones con nucleasas se llevan a cabo a 37°C durante 20 min; el fluorocromo se añade a todos los ensayos a una concentración final de 3.5X10^-4 y las lecturas se realizan en los 10-60 min posteriores a la adición de SYBR Green II. Este estudio evidencia la importancia de la fluorescencia residual después de la digestión con nucleasas, la cual es especialmente incluída en el cálculo de las concentraciones de ácidos nucleicos. Finalmente, se examinó la variabilidad de la respuesta fluorescente a diferentes patrones de ARN y ADN (rARN de hígado de ternera y ADN de bazo de ternera). La segunda parte de este estudio describe el desarrollo del protocolo de extracción, así como la aplicación de ambos protocolos para medir los cocientes ARN/ADN en muestras de plancton naturales y una comparación con los métodos basados en bromuro de etidio.